Julia Stadler¹, Lena Naderer¹, Lisa Beffort¹, Mathias Ritzmann¹, Daniela Emrich², Walter Hermanns², Kerstin Fiebig³, Armin Saalmuèller⁴, Wilhelm Gerner⁴, Bernadette Glatthaar-Saalmuèller⁵, Andrea Ladinig⁶

1. ClinicforSwine, Centre for Clinical Veterinar y Medicine, Ludwig-Maximilians-University Munich, Oberschleissheim, Alemania. 

2. Institute of Veterinary Pathology, Centre for Clinical Veterinary Medicine, Ludwig-Maximilians-University Munich, Munich, Alemania. 

3. MSD Animal Health, Unterschleissheim, Alemania.  

4. Institute of Immunology, Department of Pathobiology, University of Veterinary Medicine Vienna, Austria. 

5. Labor Dr. Glatthaar, Ochsenhausen, Alemania. 

6. University Clinic for Swine, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine Vienna, Austria.

El objetivo del presente estudio fue evaluar la seguridad y la respuesta inmunitaria en cerdas primerizas después de la inyección intradérmica de Porcilis^® PRRS en dos puntos diferentes de aplicación, en condiciones de campo. Cuarenta y cuatro primerizas fueron repartidas en tres grupos: grupo 1, con primerizas no vacunadas utilizadas como control (n=10); grupo 2, primerizas vacunadas intradérmicamente en el cuello (n=17) y grupo 3 primerizas vacunadas intradérmicamente en la región perianal (n=17). Las observaciones clínicas, las reacciones locales en la zona de inyección y el examen histopatológico del punto de inyección se utilizaron para valorar la seguridad de la vacuna. La frecuencia y el grado de los signos clínicos no fueron significativamente diferentes entre los tres grupos. Se observaron reacciones locales menores para ambos grupos de vacunación; sin embargo, a los 6, 7, 8, 9 y 15 días después de la vacunación (dpv), la puntuación media de reacción en el punto de inyección fue significativamente menor en los cerdos vacunados en la región perianal. En el examen histopatológico se observó una respuesta inflamatoria extendida con mayor frecuencia en los cerdos vacunados en el cuello. Se analizaron muestras de sangre para cuantificar la respuesta inmunitaria humoral (ELISA y prueba de neutralización del virus) y celular (IFN-g ELISPOT) post-vacunación. Los anticuerpos específicos para PRRSV estuvieron presentes en el suero de todos los animales vacunados desde 14 dpv en adelante, mientras que todos los cerdos del grupo control permanecieron negativos durante todo el estudio. Los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron significativamente mayores en los cerdos vacunados en la región perianal a 28 dpv. A 14, 21 y 28 dpv, las células secretoras de IFN-g específicas de PRRSV aumentaron significativamente en ambos grupos de vacunación en comparación con las primerizas no vacunadas. El análisis del número medio de células secretoras de IFN-g específicas de PRRSV no dio lugar a diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de vacunación. Los resultados de este estudio indican que la región perianal es un lugar de aplicación alternativo seguro para la vacunación intradérmica de cerdas con Porcilis^® PRRS. Además, la aplicación intradérmica de Porcilis^® PRRS indujo respuestas inmunitarias humorales y celulares independientes del punto de inyección.

 

Introducción

El desarrollo de los sistemas de inyección sin aguja se remonta a la década de 1930^[1]. Estos dispositivos se han aplicado en medicina humana para administrar insulina, anestésicos, hormonas de crecimiento y vacunas^[2–5]. La piel, como un componente altamente eficaz del sistema inmune, es un objetivo atractivo para la vacunación debido a su alta densidad de células inmunocompetentes, como las células de Langerhans y las células dendríticas dérmicas que se especializan en la captación de antígeno y su posterior presentación^[6]. Durante la última década, la vacunación intradérmica también ha ganado un interés creciente en la medicina veterinaria. La vía de administración de antígeno intradérmica sin aguja representa una alternativa menos invasiva y menos dolorosa que las inyecciones subcutáneas o intramusculares convencionales que usan una aguja. Además de la mejora del bienestar animal, las ventajas adicionales de la vacunación intradérmica son su capacidad de ahorro de dosis, la reducción de la transmisión iatrogénica de los patógenos, la eliminación del riesgo de lesiones por pinchazos accidentales y la mejora de la calidad de la carne debido a la falta de lesiones en el punto de inyección inducidas por la aguja^[7–9]. Según varios estudios de investigación, los cerdos tienen una alta prevalencia de defectos en la canal asociados al punto de inyección^[10]. Los decomisos de canales no sólo se atribuyen a agujas rotas, sino también a abscesos y daños musculares. Actualmente, varias vacunas disponibles comercialmente contra los patógenos más relevantes para el sector porcino, es decir, Mycoplasma (M. hyopneumoniae), virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), circovirus porcino tipo 2 y enfermedad de Aujeszky, tienen autorización para la vía de administración intradérmica sin aguja.

El PRRSV se considera uno de los principales patógenos en los cerdos y causa un impacto económico sustancial en la industria porcina de todo el mundo. Se han implementado diferentes estrategias (manejo, muestreo y eliminación, vacunación…) en rebaños infectados con PRRSV para controlar la enfermedad. Un componente clave para reducir los trastornos reproductivos y respiratorios relacionados con el PRRSV es la vacunación. Las vacunas de virus vivos modificados han demostrado ser eficaces para reducir la aparición y la gravedad de la enfermedad, así como la duración de la viremia y la eliminación del virus^[11-13]. Varios estudios que comparan la vacunación intradérmica e intramuscular del virus vivo modificado del PRRSV sugieren que la administración intradérmica de vacunas PRRSV es suficiente para desencadenar una respuesta inmunitaria humoral y celular específica similar o incluso superior a la vacunación intramuscular^[13-15]. Porcilis® PRRS está aprobado en la UE para la aplicación intradérmica, en el cuello o a lo largo del músculo de la zona dorsal, mediante un dispositivo intradérmico. Una zona de aplicación alternativa, como la región perianal, tiene el potencial de aumentar el impacto sobre el bienestar animal y aumentar la facilidad de acceso para el vacunador, particularmente en el caso de las cerdas. Sin embargo, los datos sobre la seguridad de la vacuna y la respuesta inmunitaria resultante para esta zona de aplicación son limitados hasta ahora. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para evaluar y comparar estos parámetros después de la aplicación intradérmica de Porcilis® PRRS en el cuello y la región perianal de las primerizas en un entorno de granja comercial.

Materiales y métodos 

Diseño del estudio

Para la realización del estudio se contó con una granja comercial vacía. A -7 dpv, se incluyeron en el estudio un total de 44 primerizas de raza danesa, adquiridas en un rebaño de alta sanidad, que se sabía que estaban libres de PRRSV, M. hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae, confirmadas por métodos diagnósticos  poco antes del inicio del estudio. Las primerizas fueron marcadas individualmente en la oreja y fueron asignadas aleatoriamente a uno de los tres grupos (grupos 1, 2 y 3). Después de una semana de aclimatación (0 dpv), las primerizas del grupo 2 (n=17) se vacunaron por vía intradérmica (id) en el cuello utilizando una vacuna viva atenuada del virus del genotipo 1 del PRRS (Porcilis® PRRS, MSD Animal Health, Alemania) disuelta en Diluvac Forte, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (0,2 ml). Para las primerizas del grupo 3 (n=17) se administró una dosis de Porcilis® PRRS i.d. (0,2 ml) en la región perianal (punto de inyección “off-label”). La vacunación intradérmica se realizó con un dispositivo intradérmico sin aguja (IDAL). El inyector IDAL es un inyector de chorro alimentado por batería, equipado con un receptáculo para el vial, completado con una punta, en el que se coloca un vial de vacuna o líquido de enjuague. La vacunación se realiza utilizando el cabezal de inyección, que está equipado con un cilindro mecánico de seguridad. El dispositivo es capaz de administrar una “corriente en chorro” de vacuna (0,2 ml) a través de las capas epidérmicas de la piel. Para este propósito, el dispositivo proporciona un pico inicial de fuerza de 2,0–4,2 N para penetrar en la piel seguida de una fase de administración de la vacuna con la fuerza aplicada descendente en el tiempo y una fase de caída donde la fuerza llega a cero (“curva de fuerza”). Las primerizas del grupo 1 (n=10) permanecieron sin vacunar y sirvieron como grupo control negativo. Las cerdas vacunadas (grupo 2, 3) y las cerdas del grupo control se alojaron en diferentes lotes con espacios de aire diferenciados para evitar la transmisión del virus de la vacuna a los cerdos control. La ropa, el calzado y los guantes fueron independientes para cada grupo y los materiales necesarios para el muestreo y los controles de temperatura rectal también fueron independientes para cada lote. Los animales en todos los lotes se mantuvieron en condiciones similares en términos de ventilación, temperatura y humedad del aire. Todas las primerizas se alojaron en grupos de 17 animales (grupo 2, 3) o 10 (grupo 1) en suelo parcialmente enrejillado y una superficie de 2,5 m²/cerda. Las primerizas tenían acceso libre permanente al agua potable y se proporcionó una combinación de cadena y bola de plástico como material de enriquecimiento ambiental. El aire fresco tenía su entrada a través del techo y la salida a través de un ventilador en la parte posterior de la nave. La luz artificial estuvo encendida de 6 a.m. a 10 p.m. Se alimentaron a las cerdas dos veces al día con una dieta estándar para cerdas gestantes (135 g de proteína cruda, 30 g de grasa cruda, 62 g de fibra cruda, 54 g de ceniza cruda, 12,1 de energía metabolizable por kg de pienso) proporcionando 2,5 kg de pienso al día.

La sanidad general de todas las primerizas se monitorizó diariamente durante un período de 28 dpv. Para las evaluaciones de seguridad se realizó un examen individual de los signos clínicos en las primerizas vacunadas de los grupos 2 y 3 un día antes de la vacunación, 4 h después de la vacunación y, posteriormente, diariamente, hasta 15 dpv. La observación clínica incluyó una evaluación de la salud general, el apetito, la puntuación de la condición corporal, el comportamiento, los signos respiratorios y la digestión. La temperatura rectal se midió con un termómetro digital el día anterior y en el momento de la vacunación, 4 h más tarde y en los cuatro días siguientes. Los puntos de inyección de las primerizas de los grupos 2 y 3 se monitorizaron para detectar la presencia o ausencia de reacciones como enrojecimiento, hinchazón, cambios en la consistencia, necrosis y dolor durante la palpación en el día 0 antes de la vacunación, 4 horas después de la vacunación y posteriormente, diariamente, hasta 28 dpv por el mismo observador. Los parámetros de reacción en el punto de inyección (ISR) y el examen clínico se evaluaron de acuerdo con un sistema de puntuación. Se sumaron las puntuaciones y se calculó una puntuación clínica media acumulativa y una puntuación ISR para cada día. Se recogieron muestras de sangre por punción de la vena yugular a -7, 0, 7, 14, 21 y 28 dpv y se analizaron en busca de anticuerpos específicos. A 0 dpv, antes de la vacunación, se analizaron muestras de sangre de todas las primerizas por PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) tal y como había descrito previamente Kleiboeker et al.^[16] para descartar la circulación del virus de campo. A los 7 dpv, las muestras de las primerizas del grupo 1 fueron examinadas por qRT-PCR para excluir la transmisión del virus de la vacuna al grupo control. Además, se seleccionaron al azar diez cerdas por grupo (n=30) y se recogieron muestras de sangre estabilizadas con heparina a 0, 7, 14, 21 y 28 dpv. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de estas muestras de sangre y se usaron para los ensayos ELISPOT de IFN-γ. Además, las diez muestras de sangre seleccionadas al azar de ambos grupos de vacunación (grupos 2 y 3; n=20) se examinaron para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos frente al PRRSV (nAbs) a 28 dpv. A 28 dpv, los cerdos se sacrificaron por administración intravenosa de pentobarbital (Release1, WDT-Wirtschaftsgenossenschaft Deutscher Tierärzte eG, 45 mg/kg de peso corporal). Las primerizas de los grupos 2 y 3 fueron sometidos a necropsia y exámenes microscópicos del punto de inyección. Además, el punto contralateral no tratado de cada animal sirvió como tejido de control. Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética del Gobierno del Distrito de la Alta Baviera con el código de aprobación Az.: 55.2-1-54-2532.0-43-14). 

Serología

Los sueros se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos específicos frente al PRRSV mediante un ELISA comercial (IDEXX PRRS X3 Ab Test, IDEXX Laboratories) utilizando el analizador de inmunoensayo ThunderBolt™ (Goldstandard Diagnostics U.S.A.) en el laboratorio de la Clínica para Porcino, Oberschleissheim, Alemania. Los resultados se expresaron como ratios de densidad óptica a control positivo (S/P). Según el fabricante, las muestras con S/P ≥ 0,4 fueron consideradas positivas.

Pruebas de neutralización de virus para determinar nAbs específicos frente al PRRSV 

Los nAbs de los sueros de los animales vacunados se determinaron con un ensayo de neutralización basado en fluorescencia (Ensayo FBN) en células MA104. Antes del ensayo, se cultivó una solución madre de virus definido de Porcilis® PRRS durante 3 pases en células MA104 y se tituló. Para el ensayo de neutralización, se cultivaron células MA104 (5×10³ células/pocillo, fondo plano de 96 pocillos, Greiner Bio One, Frickenhausen, Alemania) durante 2 días en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (PAN Biotech, Aiden-Bach, Alemania), suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (v/v) (FCS, PAN, Pasching, Austria), 100 UI/ml de penicilina y estreptomicina 0,1 mg/ml (ambos de PAN Biotech) hasta que se observó una confluencia del 90% en la capa de células. Los sueros derivados del experimento con animales se diluyeron 1:2 con medio de cultivo celular (DMEM con suplementos) y se valoraron en siete diluciones log² adicionales (hasta una dilución de 1:256). Posteriormente, una solución de reserva de PRRSV (título de placa 1,28×10⁶ unidades formadoras de placa (UFP)/ml) se diluyó 1:200 con DMEM sin FCS a una concentración de 6,4 x 10³ PFU/ml y se añadieron 100 μl al suero y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (RT) (dando como resultado diluciones de suero de 1:4 a 1:512). Posteriormente, las células MA104 se infectaron con 100 μl de las soluciones de suero de PRRSV preincubadas (multiplicidad de infección [MOI] de 0,5). Después de 1 h de incubación a 34 °C, se añadieron 100 μL de DMEM (4% FCS) y las células se incubaron durante 24 horas adicionales a 37 °C. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (100 μL/pocillo, 20 min. RT, Merck, Darmstadt, Alemania), se permeabilizaron con saponina al 0,1% (p/v) (100 μL/pocillo en solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10 min. RT, Sigma-Aldrich) y se incubaron con un anticuerpo monoclonal frente alPRRSV-nucleoproteína (clon P10/b1, IgG1,^[17], sobrenadante de cultivo celular de 50 μL, 45 min. a RT), seguido de dos pasos de lavado con PBS y un paso de incubación adicional con IgG1-Alexa488 de cabra anti-ratón (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 50 μL, 1:200, 30 min. RT) y dos pasos de lavado. Los análisis se realizaron con un fluorómetro (Spectrafluor, Tecan, Crailsheim, Alemania) para la detección de intensidades de fluorescencia relativa (RFI) específicas de N-proteína. Las RFI del control de virus (sin nAbs) oscilaron entre 7.000 y 9.000 unidades y las RFI del control negativo (no infectado) mostraron alrededor de 1.000 RFI. Basándose en las valoraciones finales de los sueros se determinaron los títulos de nAb cuando los valores de RFI de la dilución en suero alcanzaron el nivel de RFI del control de virus no tratado.

Ensayo ELISPOT para cuantificar células secretoras de IFN-g específicas de PRRSV. 

Los números de células secretoras de IFN-γ específicas de PRRSV (IFN-γ-SC) se determinaron en PBMC. Las PBMC se aislaron de muestras de sangre heparinizadas por centrifugación en gradiente de densidad (Pancoll humano; densidad, 1.077 g/ml; PAN Biotech)^[18]. El ensayo IFN-γ ELISPOT se realizó como se describió anteriormente^[19]. En resumen, las placas de 96 pocillos (MSIPS4510, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) se incubaron durante la noche con un anticuerpo monoclonal específico para IFN-γ porcino (Clon pIFN-γ, Mabtech, Nacka Strand, Suecia), ajustado a 10 μg/mL. Después del lavado, se agregaron PBMC recién aisladas a los pocillos (3 × 10⁵ PBMC por pocillo) en RPMI 1640 con glutamina estable (PAN Biotech) suplementada con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (v/v) (FCS, PAN Biotech), 100 UI/ml de penicilina y estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN Biotech). Las células fueron estimuladas con la vacuna Porcilis® PRRS reconstituida en medio de cultivo celular y ajustada a MOI=1. Las células cultivadas en este medio sólo sirvieron como control negativo. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado. Después de 24 h, se descartaron las PBMC y las placas se incubaron con un segundo anticuerpo biotinilado específico de IFN-γ (clon PAN, Mabtech, 1 μg/ml) seguido de incubación con estreptavidina fosfatasa alcalina (Roche, Mannheim, Alemania). Finalmente, se añadió sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul tetrazolio (Sigma-Aldrich, Viena, Austria). La lectura se realizo en un sistema de recuento automatizado basado en cámara (AID, Straßberg, Alemania). Las frecuencias de los SC de IFN-γ se calcularon restando los números de puntos de cultivos incubados a la media de los números de puntos detectados después de la estimulación con la vacuna PRRSV.

Examen histopatológico

Después de la fijación de las muestras de tejido en una solución de formaldehído tamponada al 4%, se realizó la inclusión y corte en parafina; los cortes de 4–5 μm de grosor se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y se sometieron a evaluación histopatológica mediante microscopía óptica por dos investigadores independientes en un estudio ciego. Además, la tinción inmunohistoquímica para células T y B se realizó usando anticuerpos frente a CD3 (policlonal de conejo anti CD3 humano, Dako, Glostrup, Dinamarca) o CD20 (anticuerpo de conejo específico de epítopo, Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Alemania) y CD79a (ratón antihumano CD79a, Linaris Biologische Produkte GmbH, Dossenheim, Alemania), respectivamente. La puntuación de la inflamación se realizó de la siguiente manera: (-) no, (+) leve, (++) moderada y (+ ++) reacción inflamatoria fuerte. Además, se estimó la dimensión de la lesión y se registró la profundidad y expansión de las células inflamatorias invasoras en las estructuras dérmicas. La extensión de la lesión se estimó en comparación con el corte completo expresado como porcentajes (1–5%, 6–10%, 11–15%, 16-20%, 21–25%,> 25%).

Análisis estadístico

El cálculo del tamaño de la muestra se basó en la prueba de Mann-Whitney-U con α=0,025 y β=0,20 usando una relación de casos y controles de 4. Al agregar un drop out, reveló n=17 para ambos grupos de vacunas y n=10 para el grupo control basado en la respuesta de anticuerpos IgG específica para PRRSV como variable primaria. La puntuación del examen clínico, la puntuación ISR local, la temperatura rectal, los anticuerpos IgG específicos para PRRSV, las células productoras de IFN-γ en los títulos ELISPOT y PRRSV-nAb se compararon entre los grupos de estudio mediante la prueba de Mann-Whitney-U después de probar la distribución normal de datos. La persistencia de ISR local se evaluó en tablas de contingencia con las pruebas de chi-cuadrado de Pearson. Se usó el coeficiente de correlación de rango de Spearman para determinar una correlación entre las células productoras de IFN-γ y los títulos de nAb. Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistics 22, SPSS Inc., IL, EE. UU. El nivel de significación fue del 5% con un intervalo de confianza del 95%.

Resultados

Seguridad de la vacunación intradérmica

Para evaluar la seguridad de la vacuna intradérmica Porcilis® PRRS en la región perianal, se recopilaron datos locales y sistémicos de todas las primerizas hasta 28 dpv. Durante el período de observación, se registró tos en una cerda del grupo control. Se produjo una leve taquipnea en ambos grupos de vacunación (grupo 2: 3 animales, grupo 3: 4 animales). Un animal vacunado en el cuello (grupo 2) tuvo una ingesta reducida de alimento y un estado de salud general deteriorado debido a una cojera en la extremidad posterior. No se encontraron diferencias significativas en las puntuaciones clínicas medias entre ambos grupos de vacunación y entre los animales vacunados y los animales del grupo control (datos no mostrados). En ambos grupos vacunados, la temperatura rectal media permaneció dentro del rango fisiológico y no difirió significativamente entre los grupos (datos no mostrados).

Las reacciones locales en el punto de inyección, descritas como enrojecimiento y pápula con un tamaño de hasta 4 mm de diámetro, se valoraron en todas las cerdas de ambos grupos de vacunación inmediatamente después de la vacunación intradérmica. A nivel individual, se observó una puntuación máxima de 7 sobre 12 puntos de puntuación en una primeriza del grupo 2 a 24 y 25 dpv y 9 puntos en una primeriza del grupo 3 a 16 y 17 dpv. Con respecto a los parámetros individuales, el diámetro medio del enrojecimiento fue significativamente mayor en los cerdos del grupo 2 (6 dpv: 1,42 cm; 7 dpv: 1,71 cm; 15 dpv: 1,43 cm) en comparación con los cerdos del grupo 3 (6 dpv: 0,71 cm; 7 dpv: 0,86 cm; 15 dpv: 0,55 cm) a 6, 7 y 15 dpv. En el caso de las primerizas que recibieron Porcilis® PRRS en el cuello, el diámetro máximo de enrojecimiento fue de 2,77 cm (una cerda, 7 dpv), mientras que se observó un diámetro máximo de enrojecimiento de 1,64 cm (una cerda, 4 dpv) en las cerdas vacunadas en la zona perianal. En las primerizas que fueron vacunadas en la región perianal a los 6, 7, 9 y 14 dpv, se observó hinchazón más grave en las cerdas del grupo 2 (puntuación promedio de hinchazón: 6 dpv: 0,53, 7 dpv: 0,59; 9 dpv: 0,41; 14 dpv: 0,41) en comparación las del grupo 3 (6 dpv: 0,12; 7 dpv: 0,06; 9 dpv: 0; 14 dpv). Los demás parámetros (dolor durante la palpación, necrosis, induración y grado de enrojecimiento) no difirieron significativamente entre ambos grupos de vacunación (datos no mostrados). En el día 28, el número de cerdos con ISR no difirió significativamente entre ambos grupos de vacunación (grupo 2: 14/17; grupo 3: 11/17).

El examen histopatológico reveló reacciones inflamatorias en el punto de inyección en todos los animales tratados, mientras que ninguno de los puntos de control presentó inflamación. El sitio de inyección en todos los animales de ambos grupos incluyó un foco inflamatorio de dimensión variable con varios puntos de mayor densidad de infiltrados celulares. Además, se encontraron focos de necrosis y calcificación distrófica en la mayoría de los animales de ambos grupos de vacunación (Figs. 1 y 2). Los hallazgos histopatológicos se acentuaron en la capa papilar de la dermis. Los casos individuales (1 animal inyectado en la zona perianal y 7 animales inyectados en el cuello) mostraron infiltrados que llegaban al tejido adiposo subcutáneo. La extensión de la lesión difirió significativamente (p = 0,002) entre ambos grupos de vacunación (media: grupo 2: 16–20%; grupo 3: 11–15%). Los linfocitos dominan las lesiones inflamatorias, que representan a las células T y B con un patrón de distribución similar en todos los animales. Además, se detectaron células plasmáticas y algunos neutrófilos y macrófagos (datos no mostrados). En seis animales del grupo 2 y en cuatro animales del grupo 3, se encontraron células gigantes multinucleadas en la periferia de los focos necróticos (datos no mostrados). Además, en todos los animales, se observo fibrosis en el punto de inyección.

Respuesta inmunitaria frente a  PRRSV

Para excluir la circulación del virus PRRS de campo, así como la transmisión del virus de la vacuna al grupo control, se realizó una qRT-PCR a 0 dpv con muestras de todos los animales y a 7 dpv en muestras de animales control. Las muestras de sangre de todas las primerizas fueron negativas para el ARN del PRRSV por qRT-PCR antes de la vacunación y no se pudo detectar el ARN del PRRSV en las primerizas del grupo control a 7 dpv.

Respuesta de anticuerpos ELISA específicos para PRRSV

La respuesta inmunitaria humoral frente a PRRSV se evaluó en términos de anticuerpos específicos de PRRSV en suero con un ELISA disponible comercialmente. Antes de la vacunación, a -7 dpv, todas las primerizas eran seronegativas. Las muestras de sangre de las primerizas no vacunadas del grupo control arrojaron resultados negativos en todos los puntos temporales de recogida. No se pudieron detectar anticuerpos frente al PRRSV a 0 dpv y 7 dpv en muestras de suero de cerdas vacunadas (grupos 2 y 3). Sin embargo, en el día 14, los anticuerpos específicos frente al PRRSV estaban presentes en el suero de todos los animales vacunados. Todas las primerizas de los grupos 2 y 3 permanecieron seropositivas durante el resto del estudio. No se observaron diferencias significativas en la relación S/P de anticuerpos entre ambos grupos de vacunación.

NAbs específicos de PRRSV

Para definir las respuestas de nAb, los títulos de virus nAb se determinaron mediante el ensayo FBN a 28 dpv. Se detectaron NAb en 8/10 cerdas vacunadas en la región del cuello con títulos que van desde 1:16 a 1: 256. Sólo 2 primerizas alcanzaron títulos altos de 1:256, mientras que los títulos de nAb de las 6 primerizas restantes oscilaron entre 1:16 y 1:64. Debido al sobrecrecimiento bacteriano durante la incubación no se pudieron evaluar los nAbs en 2 cerdas vacunadas en la región perianal. Las 8 cerdas examinadas fueron positivas para nAbs, con títulos que oscilaron entre 1:16 y 1:512. Las primerizas vacunadas por vía intradérmica en la región perianal tenían títulos de nAb significativamente más altos que los cerdos vacunados por vía intradérmica en el cuello (p = 0,043). Por el contrario, no se detectaron nAbs específicos de PRRSV en sueros de primerizas no vacunadas (grupo 1).

Frecuencia de células secretoras de IFN-γ específicas de PRRSV 

Para caracterizar aún más la respuesta inmunológica a la vacuna intradérmica de PRRSV, se midieron los SC de IFN-γ específicos de PRRSV. A 0 dpv, los SC de IFN-γ específicos de PRRSV no pudieron detectarse en animales de los tres grupos. A 7 dpv, se observaron números bajos de SC de IFN-γ específicas para PRRSV en ambos grupos de vacunación. La frecuencia de tales células aumentó aún más hacia los 14 dpv en ambos grupos, aunque se observaron variaciones considerables entre animales. A 21 dpv, en promedio, se observó una disminución menor de los SC de IFN-γ en ambos grupos, seguido de un aumento a 28 dpv. En contraste, los animales del grupo control mostraron una respuesta de IFN-γ muy baja a un máximo de 3 SC/3 x 10⁵ PBMC en todos los puntos temporales examinados (datos no mostrados). A los 7, 14, 21 y 28 dpv, el número de SC de IFN-γ en ambos grupos de vacunación (grupo 2, 3) fue significativamente diferente en comparación con el grupo control (grupo 1). El número de SC de IFN-γ específicos para PRRSV tendió a ser mayor en los cerdos vacunados en el cuello en comparación con las primerizas vacunadas en la región perianal. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos de vacunación en ninguno de los puntos temporales estudiados (7, 14, 21, 28dpv) (p <0,05).

Asociación entre la respuesta nAb y las células secretoras de IFN-γ. 

La frecuencia de los SC de IFN-γ específicos de PRRSV/3×10⁵ PBMC se comparó con los nAbs de animales individuales. Curiosamente, no hubo niveles detectables de nAbs en dos animales 28 dpv a pesar de su respuesta IFN-γ. La comparación de los títulos de PRRSV-nAb y los SC de IFN-γ sugirió que los animales con títulos bajos de PRRSV-nAb tenían SC de IFN-γ más altos que los animales con títulos altos de PRRSV-nAb. Por lo tanto, no se observó correlación positiva entre los títulos de nAb y el número de SC de IFN-γ (p = 0,542).

Discusión 

Aunque varios estudios han demostrado que la aplicación intradérmica de una vacuna de PRRSV atenuada en el cuello puede inducir eficazmente una respuesta inmunitaria protectora^{[13, 14]}, hasta la fecha no había estudios disponibles que hubiesen investigado la seguridad y la eficacia de diferentes puntos de aplicación. Como el cuello es el punto más común de inyección, principalmente intramuscular, en el ganado reproductor, un punto de aplicación alternativo podría reducir el estrés para el animal y simplificar el proceso de aplicación para el operario. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para evaluar la seguridad y la respuesta inmunitaria humoral y celular en las primerizas después de la vacunación intradérmica con Porcilis® PRRS en la región perianal. Dado que la eficacia de la vacunación intradérmica de Porcilis® PRRS en términos de protección clínica ya quedó demostrada en un estudio previo^[13], no se consideró la infección experimental en el presente estudio. Además, por consideraciones éticas con respecto a la reducción de animales utilizados en experimentos, no se incluyó un grupo intramuscular en el diseño del estudio, ya que los resultados de estudios previos indican que Porcilis® PRRSV administrado por vía intradérmica puede inducir de manera eficiente una respuesta inmunitaria protectora comparable, o en algunos casos superior, a la ruta intramuscular^{[13-15, 20]}.

Con respecto a la seguridad, no se encontraron diferencias significativas en la frecuencia y el grado de los signos clínicos entre ambos grupos de vacunación y entre los animales vacunados y los animales control. De acuerdo con otros estudios, la aplicación intradérmica de Porcilis® PRRS no indujo reacciones sistémicas, ni un aumento de la temperatura rectal^[14]. Se observaron ISR locales en ambos grupos de vacunación hasta 28 dpv. Por el contrario, en un estudio reciente, la ISR después de la aplicación intradérmica de Porcilis® PRRS se resolvió en 28 dpv^[21]. Sin embargo, en coherencia con otros estudios, utilizando la vía intradérmica de vacunación, las ISR observadas fueron de menor grado^{[20, 22, 23]}. En el presente estudio, las alteraciones de la piel fueron significativamente más graves a los 6, 7, 8, 9 y 15 dpv en cerdos vacunados intradérmicamente en el cuello en comparación con los cerdos vacunados en la región perianal. Como las reacciones locales en el punto de inyección podrían estar asociadas con dolor, la vacunación en la región perianal podría mejorar el bienestar animal. El grado general y el tipo de inflamación detectada por el examen histopatológico fue comparable entre ambos grupos de vacunación. Sin embargo, la extensión de la inflamación fue mayor en los cerdas vacunadas en el cuello en comparación con las cerdas inyectadas perianalmente. Las diferencias en la extensión de la inflamación entre ambos grupos de vacunación reflejan la tendencia a puntuaciones más altas en la zona de inyección observada microscópicamente en cerdos vacunados en el cuello. Según la literatura, la profundidad de penetración puede variar entre los diferentes puntos de aplicación debido a la variabilidad de la piel (es decir, grosor de la piel, superficie de la piel y densidad del pelaje)^[24]. Por lo tanto, el punto de aplicación parece tener un efecto sobre los niveles de reacción extremadamente visibles y la extensión de la lesión en el punto de inyección.

La aplicación de  la vacuna por vía intradérmica provocó una respuesta de anticuerpos específicos frente al PRRSV medida por ELISA en todos los animales (34/34) de ambos grupos de vacunación a 14 dpv. A pesar de que estos resultados coinciden con estudios previos^[14], se admite que la concentración de anticuerpos séricos medidos por ELISA no puede considerarse como prueba de la inmunidad protectora frente a PRRSV^[25–27]. Por el contrario, la respuesta inmunitaria mediada por células en términos de frecuencia de SC de IFN-γ ha sido ampliamente utilizada para evaluar la eficacia de la vacuna^{[13, 28-32]}. De acuerdo con Zuckermann et al.^[29] la respuesta IFN-γ puede usarse como indicador de inmunidad protectora, por su parte Martelli et al.^[13] demostró una asociación clara entre la protección clínica y la cinética de la respuesta inmunitaria mediada por células. Del mismo modo, Lowe et al.^[30] mostró que el número de células productoras de IFN-γ medido por ELISPOT se correlacionó con la protección frente al PRRSV en tres de los cuatro rebaños comerciales que experimentaron brotes de PRRSV y los resultados de Diaz et al.^[33] indican una fuerte implicación de IFN-γ en el desarrollo de la inmunidad frente al PRRSV. Además, Charerntantanakul et al.^[28] mostró que la expresión de IFN-γ por varios subconjuntos de células T se correlacionó con lesiones pulmonares reducidas y viremia. Debido a estos hallazgos previos, en nuestro estudio no se realizó una infección de desafío, en su lugar, consideramos el análisis simultáneo de linfocitos y nAbs productores de IFN-γ específicos frente al PRRSV (ver también más abajo) como lecturas adecuadas para evaluar la eficacia de la vacuna. En estudios previos, la administración intradérmica de vacunas PRRSV provocó una respuesta IFN-γ similar, o incluso superior, a la aplicación por vía intramuscular^{[13, 15]}. En el presente estudio, se detectó un aumento menor en los SC de IFN-γ en algunos cerdos de ambos grupos de vacunación tan pronto como 7 dpv. El 14 dpv, los IFN-γ-SC fueron evidentes en la gran mayoría de los animales de ambos grupos de vacunación. Por el contrario, un estudio diferente que investiga la ruta intradérmica de vacunación frente al PRRSV encontró un menor porcentaje de animales con IFN-γ-SC específicos frente al PRRSV a 14 dpv [13]. En el presente estudio, después de 14 dpv, se observó un aumento adicional de IFN-γ SC. Sin embargo, los animales individuales alcanzaron un nivel máximo el día 14, seguido de una disminución de los SC de IFN-γ a 21 dpv y un aumento posterior al final del período de observación (28 dpv). Esto está en contraste con otros estudios que describen un aumento gradual en la frecuencia de IFN-γ SC^[32]. Sin embargo, la cinética bifásica de SC de IFN-γ también ha sido observada en otros estudios^{[33, 34]} y podría atribuirse a la respuesta altamente variable de SC de IFN-γ entre animales individuales que se ha observado en éste y también en otros estudios^{[34, 35]}. De acuerdo con Ferrari et al.^[15], la variación entre animales fue mayor en los cerdos vacunados por vía intradérmica en comparación con los cerdos vacunados por vía intramuscular. Los resultados de un estudio reciente sugieren que la variabilidad interindividuo en los marcadores de inmunidad inducida por la vacuna PRRSV, incluidos los niveles de nAb y las respuestas de IFN-γ, puede estar regulada por factores genéticos del hospedador^[36]. Sin embargo, el número medio de SC de IFN-γ no difirió significativamente entre ambos grupos de vacunación. La intensidad de la respuesta de IFN-γ observada en nuestro estudio es consistente con los resultados obtenidos en estudios previos^{[13, 15, 29]}. En general, se observa que la frecuencia de IFN-γ SCs es baja después de la vacunación o infección^{[13, 15, 29]}. Sin embargo, los resultados de Klinge et al.^[37] indicaron que la inoculación con cepas virulentas de PRRSV provoca un mayor número de SC de IFN-γ que la inoculación con una vacuna viva modificada. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que una comparación de los SC de IFN-γ entre diferentes estudios debe hacerse con precaución ya que los resultados están influenciados por la variabilidad entre ensayos causada por diferencias en el tiempo de reestimulación, MOI, tipo de antígeno utilizado para reestimulación, la cepa particular de PRRSV utilizada para la infección y reestimulación, así como el estado inmunitario y la edad del animal^[37]. En el presente estudio, se utilizó el virus de la vacuna como virus de recuerdo para realizar una reestimulación homóloga. De acuerdo con nuestra experiencia y datos internos, se inducen SC de IFN-γ en cerdos vacunados después de la reestimulación con el virus de la vacuna homóloga y con el virus de campo heterólogo (datos no publicados). Estos hallazgos pueden explicarse por datos de Mokhtar et al.^[38], quienes utilizaron una biblioteca de péptidos que abarca todo el proteoma PRRSV para analizar la especificidad de antígeno de las respuestas de las células T. Los autores pudieron identificar epítopos altamente conservados presentes en diferentes aislados de PRRSV.

Aunque varios autores han destacado la importancia de los nAbs para la inmunidad protectora contra el PRRSV^{[26, 27, 39]}, el papel de los nAbs en la eliminación de la viremia y la protección contra la enfermedad ha sido objeto de controversia^[40-42]. Los resultados de un estudio anterior indican que la protección depende de la cantidad de nAbs. Sin embargo, deben considerarse las diferencias dependientes de la edad ya que se necesitan concentraciones más altas de nAbs para obtener inmunidad esterilizante en lechones jóvenes que en cerdas^[43]. Según estudios previos, las vacunas atenuadas frente al PRRSV inducen una respuesta nAb no detectable o baja, particularmente si los cerdos sólo se vacunan una vez^{[29, 44-46]}. Ferrari et al.^[20] no observaron nAbs en cerdos vacunados por vía intramuscular o intradérmica con una vacuna de PRRSV viva modificada antes del desafío (0–35 dpv). En contraste, la mayoría de los cerdos en nuestro estudio (16/18) tenían nAbs a 28 dpv. Además, vale la pena señalar que se detectaron títulos altos de nAbs en el presente estudio. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los títulos de nAb de diferentes estudios no se pueden comparar directamente debido a varios factores que influyen en el resultado, como por ejemplo la cepa particular de PRRSV, las condiciones del cultivo de virus, el método de visualización, etc. En el presente estudio, las primerizas vacunadas por vía intradérmica en la región perianal tenían títulos de PRRSV-nAb significativamente más altos que los cerdos vacunados por vía intradérmica en el cuello. Curiosamente, dos animales del grupo vacunado en el cuello no desarrollaron nAbs en 28 dpv a pesar de tener un número medio a alto de SC de IFN-γ específicos para PRRSV. Como se sabe que los nAbs aparecen tarde después de la infección/vacunación, típicamente 28 días^{[32, 47]}, la falta de nAbs a 28 dpv podría atribuirse a su retraso en el desarrollo. Es bastante notable que, en contraste con estudios anteriores^{[20, 34]}, no se observó asociación entre los virus nAbs y los niveles de IFN-γ-SC bajo las condiciones de este estudio. Esto podría explicarse por el breve período de investigación de 28 días. Sin embargo, parece más probable que esta observación se atribuya, principalmente, a la variabilidad extrema de la respuesta de IFN-γ SC observada entre animales individuales.

Conclusiones

Se han realizado varios estudios que comparan la respuesta inmunitaria humoral y celular inducidas por la vacunación intramuscular e intradérmica del PRRSV. Sin embargo, se requieren estudios actualizados sobre la compatibilidad de diferentes puntos de aplicación intradérmica. Como el cuello es una zona habitual para la vacunación, es muy recomendable encontrar un punto de aplicación alternativo para mejorar el bienestar de los animales. Los resultados del presente estudio sugieren de forma contundente que la región perianal podría ser un punto de aplicación seguro y que la aplicación intradérmica de Porcilis® PRRS en la región perianal induce una respuesta inmunitaria celular y humoral similares a la aplicación en el cuello.

Bibliografía

La bibliografía de este artículo puede solicitarse dirigiéndose al email:

info@produccionanimal.com

 

Este artículo es una traducción y adaptación del trabajo original publicado, bajo el título de  “ Safety and immune responses after intradermal application of Porcilis PRRS in either the neck or the perianal region” en la revista  PLoS ONE 13(9): e0203560. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0203560